上一期我们介绍了 物质平衡试验的目的、试验的准备以及试验的设计，这一期我将继续介绍如何对我们在临床操作中收集的样品进行处理，如何进行分析、如何对结果进行评估等。

到现在为止，我们获得了所有受试者的血样、尿样和粪便样品，其中粪便样品需要与水混合以1:2或1:3的比例进行  混合，制成匀浆。在血样的样本检测之前，需要对样本进行合并处理（pooled）。一般有三种合并方法：同一受试者合并，同一采样点合并以及全部合并。第一种方法就是将同一受试者的全部采样点合并在同一个样本中，这样可以获得整个回收期间各药物相关物质的占比等数据，也可以比较不同受试者之间的差异性。类似的第二种方法是在同一个采样点或采样周期，将所有受试者的样本按同比例混合（即每受试者取一小份），这样可以观察每个时间点各药物相关物质的变化情况，非常具有参考价值，但同时也是最耗费时间和仪器的。第三种方法是最省时间和成本的，是将所有受试者每个采样点按比例混合并将所有采样点合并获得的。具体采用那种方法，得基于实际的数据需要和时间进度来决定。对于排泄物的合并处理，一般是在每个采样周期，按同比例混合每个受试者的样品。

人体物质平衡试验需要我们回收一定的放射性活性，这一比例一般为90%（总放射性），或者连续两个采样周期回收的排泄物放射性小于1%。当然这个回收率并不是强制性要求，它意味着如果回收率在这之下，需要对试验的设计操作以及分析过程进行一定的评估，最终应该得出一个可能的结论以说服监管机构对低回收率的接受。对放射性的检测传统上采用液体闪烁计数器（LSC）进行试验过程中的实时检测，确保我们回收了足够的放射性。许多的物质平衡试验都是通过LSC进行检测，比如辉瑞的芦卡帕利、诺华的卡马替尼等。这一过程可能需要使用我们最开始准备药品过程中获得的DPM/ng，也就是每分钟计数/ng的数值来进行计算。

代谢物谱的检测一般是使用HPLC方法进行分离检测的，分为离线和在线检测两种方法。离线检测是通过HPLC对样本进行分离，随后收集不同时间产出的小份样本，随后可以使用串联质谱，流式闪烁分析仪（FSA），加速器质谱（AMS）进行结构信息的或放射性信息的收集。而在线检测则是HPLC和串联质谱以及放射性分析仪器进行联用，从HPLC分离的样本通过分流器按比例进入两种仪器同时进行检测。在样本分析的过程中，我们一般通过放射性计数而非峰面积计算物质的含量，这样更加准确，并且不需要仪器针对每一种化合物的结构进行校正。选择哪种放射性检测方法主要与放射性活度有关。

礼来正在研发中的小分子BACE抑制剂LY3202626的物质平衡试验中，由于其血浆放射性太弱（给药剂量100μCi），所以采用了AMS方法帮助建立了其代谢物谱。其504h的排泄物收集时间仅仅获得了75%的总回收率，提示LY3202626消除过程极其缓慢。其血浆放射性半衰期为32.5h，原型半衰期仅为24.5h，所以血浆中存在长半衰期的代谢物。同时，礼来认为，代谢物可能经由肝肠循环，通过肠道菌群去结合被重新吸收，从而大幅延长了半衰期。

对血样的分析可以让我们获得许多信息，如循环的代谢物谱，循环中代谢物的含量与占比。我们需要重点关注的是不成比例的药物代谢物。什么叫不成比例的药物代谢物呢，根据FDA药物代谢物安全性测试（Safety Testing of Drug Metabolites – Guidance for Industry）中的定义，不成比例的药物代谢物指的是仅在人体内出现的代谢物或者在人体内的血浆浓度大于其在非临床动物研究中动物体内的血浆浓度的代谢物。一般来说重点应该关注占总药物相关暴露度10%以上（以稳态AUC计算）的不成比例的药物代谢物。在样本分析的过程中，如果我们发现某代谢物是不成比例的药物代谢物，而且其还占总暴露度AUC的10%以上，我们就可能需要对其进行进一步的研究。分情况讨论，如果代谢物是人类特有的，则必须开展额外的非临床试验，如果不是人类特有的但是血浆浓度已经大于前期开展的非临床动物体内的浓度的话，也应该开展非临床试验以覆盖代谢物的人体血浆浓度。如果前期非临床试验所测试的代谢物浓度范围已经覆盖了人体的血浆浓度，则无需开展更多的研究。需要注意的是，这个10%的界限应该根据代谢物本身的特性进行评估，比如对于酰基葡糖醛苷，由于其可以与生物大分子共价的结合，所以具备显著的毒性，可以适当降低10%的界值。同时，这些非临床研究必须在III期临床试验之前完成，这使得对物质平衡研究的时间选择有一定的要求。

如果在血样的分析中我们发现，原型药物的半衰期比放射性半衰期短，这意味着循环中存在长放射性的代谢物，我们需要对其进行分析，是否具有药理毒理活性。如果属于不成比例的代谢物，还应该开展额外的非临床研究。代谢物半衰期过长，会不会在多次给药过程中产生蓄积，会不会产生药理毒理作用，这些问题都必须在III期临床试验之前予以解决。

对血浆代谢物谱的识别应该结合已有的前期研究数据，比如前期的临床PK研究，体外酶学及DDI研究等，有助于我们对代谢物谱的识别。对于主要的代谢物，如AUC占比超过25%或其活性占比超过10%的情况下，需要有相应的体外DDI数据进行支持，包括主要的I相代谢酶（P450等）。如果代谢物是直接II相代谢的产物，则考虑研究其与UGT酶家族（如UGT1A1和UGT2B7等）的相互作用。一般来说这些应该在临床前的体外酶学和DDI研究中进行分析。

对排泄物样本的分析主要回答如下几个问题：有多少药物从经由粪便排泄？有多少药物经由肾脏途径排泄？排泄物的代谢物谱如何？药物的排泄途径是啥？药物的消除机理是啥？而这些问题会提升我们对药物本身的理解，同时也会指导我们特殊人群的用药。举个例子，如果肾脏途径是主要的排泄途径，说明药物吸收的程度高，尿液回收放射性的比值+血浆放射性比值与总放射性的比值，其实就代表了药物吸收率（Fa）的下限值。为什么是下限值呢，因为粪便中的放射性不一定来源于吸收后的药物，可能是没有吸收的药物，可能是在肠道内代谢形成的代谢物。这就是为什么推荐在进行口服人体物质平衡的试验的同时增加静注的物质平衡试验。这样可以直接计算出真实的药物吸收率。特别是如果粪便中的原型药物占比较高的情况下，建议开展绝对生物利用度研究的同时，可以考虑开展药物在粪便中的稳定性，评估其是否可能在肠腔内被代谢。另外，对吸收率的评估也有助于BCS的生物豁免申请。ICH M9R2中对渗透性的定义，绝对生物利用度大于85%或者尿液中原型药物回收率大于85%或尿液中原型+I相氧化代谢物+II相结合代谢物的总和回收率大于85%的情况下，可以被定义为高渗透性。

下面我们举个例子以说明Fa对我们分析药物消除机制的重要性：

上面这张图片展示了某药物的消除机制，可以看到原型药物在粪便中占到了50%的放射性，在不知道Fa的情况下，这50%的放射性可能来自于两个方面：1. 药物口服后没有完全吸收，直接随着粪便排出体外；2. 药物被吸收，但由通过胆汁排泄或肠壁分泌的方式排入肠腔内。我们假设通过绝对生物利用度试验或者静注的物质平衡试验得到了Fa的值，当Fa=100%的时候，药物完全被吸收，也就是说粪便中所有的原型药物都是通过胆汁排泄或者肠壁分泌，这个时候需要注意是否有p-gp或BCRP的DDI。当Fa=50%，粪便中所有的原型药物都是没有被吸收的，所以其他的消除途径变为主要的消除途径，这个时候建议分析相应路径的代谢酶和转运体的DDI。

正如上面例子所示，药物的排泄过程与转运体息息相关，常见的与药物相关的转运体包括：p-糖蛋白（p-gp）、乳腺癌耐药蛋白（BCRP）、有机阴离子转运多肽（OATP1B1/1B3）、有机阴离子转运体（OAT1/3）、有机阳离子转运体（OCT2）等。通过对排泄数据的分析，可以提供一定的提示来指导是否应该开展相应的转运体的体外研究。参考FDA临床药物相互作用-细胞色素P450酶以及转运体介导的药物相互作用指南（Clinical Drug Interaction Studies-Cytochrome P450 Enzyme- and Transporter-Mediated Drug Interactions – Guidance for Industry）：

• 如果有证据表明肠道吸收、胆汁排泄或者肾脏主动排泄对PK参数的变异性有显著贡献的情况下，应该考虑研究p-gp和BCRP介导的DDI。如果我们开展了口服和静注的物质平衡研究，是可以得出肠壁分泌和胆汁排泄对原型药物的排泄具有什么样的影响，因为静注情况下，只有这两种方式可能会使得原型药物出现在粪便中。所以，当我们发现这两种方式对原型药物的排泄具有显著的作用，那么对p-gp和BCRP等肠壁常见外排蛋白的DDI研究就显得十分必要。

• 又如有证据表明肝脏消除或胆汁排泄是药物主要的消除途径的话，并且药物本身特性决定了其被动转运程度小，肝脏组织有蓄积现象等情况，那么应该考虑有机阴离子转运多肽（如OATP1B1/1B3）介导的DDI，因为OATP家族是肝细胞主动转运药物的主要转运受体。

• 有证据表明药物经过显著的肾脏主动排泄过程（比如渗透性差或溶解性差却具有比较高的尿液回收率，占到了全身清除率的25%以上），考虑有机阴离子转运体（OAT1/3）以及多药及毒性化合物外排转运体（MATE）介导的DDI。这些转运体都是将药物从血液转移至尿液的主要转运体。

在开展体外DDI试验之后，如果有必要可以考虑继续开展体内DDI试验，以研究这些相互作用在体内的重要性，应在III期临床开展之前完成相应的研究。

最后阐述一下人体物质平衡研究开展的时机，目前各国并没有指导原则或法律法规规定了此研究开展的时机，在去年12月，CDE发布了《创新药临床药理学研究技术指导原则》，其中提到，物质平衡研究通常在确证性临床前完成（III期临床），建议在早期临床中尽早开展相关研究。从另一个角度来说，物质平衡研究的结论对其他如DDI研究，长期致癌性试验等需要在III期临床之前或者与III期临床同步开展的研究有重要的指导作用。所以一般来说，物质平衡试验在初步判断化合物具有有效性之后就可以开展了，比如Ib期或者IIa期。综合考虑物质平衡试验的成本因素，在获得有效性数据之前开展风险较大。2021年是我国创新药百花齐放的一年，CDE共收到创新药申请1400余项，化药800余个，其中绝大多数都应开展了人体物质平衡试验。了解到物质平衡试验的重要性，希望这篇文章可以给予大家对物质平衡试验一个基本的认识，在实际的试验过程中，关注药物本身的特点，灵活的设计试验，从而提供更多优质有效的信息，助力新药的临床研究。

1. 王璐, 张泽茹,and 邵凤."~(14)C标记人体物质平衡研究设计和结果简介." 中国临床药理学杂志 37.05(2021):568-571. doi:10.13699/j.cnki.1001-6821.2021.05.018.

2. 王璐, 张泽茹,and 邵凤."~(14)C标记人体物质平衡研究设计和结果简介." 中国临床药理学杂志 37.05(2021):568-571. doi:10.13699/j.cnki.1001-6821.2021.05.018.

3. 孙鲁宁, et al."创新药人体物质平衡与代谢研究同位素示踪技术平台建设的实践与思考." 中国新药杂志 30.17(2021):1570-1573. 

4. 国家药品监督管理局, “创新药临床药理学研究技术指导原则”, 2021

5. 国家药品监督管理局, “药物相互作用研究技术指导原则”, 2021

6. Penner, Natalia et al. "Human Radiolabeled Mass Balance Studies: Objectives, Utilities And Limitations". Biopharmaceutics & Drug Disposition, vol 30, no. 4, 2009, pp. 185-203. Wiley, https://doi.org/10.1002/bdd.661.

7. Roffel, A.F. et al. "An Evaluation Of Human ADME And Mass Balance Studies Using Regular Or Low Doses Of Radiocarbon". Journal Of Labelled Compounds And Radiopharmaceuticals, vol 59, no. 14, 2016, pp. 619-626. Wiley, https://doi.org/10.1002/jlcr.3473.

8. U.S. The Administrative Committee of the Federal Register. "Code Of Federal Regulations Title 21，Part 361． 1: Radioactive Drugs For Certain Research Uses". Ecfr.Gov, 2022, https://www.ecfr.gov/current/title-21/chapter-I/subchapter-D/part-361/section-361.1.

9. U.S.  Department of Health and Human Services，Food and Drug Administration，Center for Drug Evaluation and Research，Center for Biologics Evaluation and Research． The Radioactive Drug Research Committee: Human Research Without An Investigational New Drug Application, Aug 2010, https://www.fda.gov/media/76286/download, Accessed 19 Feb 2022.

10. ICRP, 1992. Radiological Protection in Biomedical Research. ICRP Publication 62. Ann. ICRP 22 (3).

11. Penner, Natalia et al. "Radiolabeled Absorption, Distribution, Metabolism, And Excretion Studies In Drug Development: Why, When, And How?". Chemical Research In Toxicology, vol 25, no. 3, 2012, pp. 513-531. American Chemical Society (ACS), https://doi.org/10.1021/tx300050f.

12. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Biologics Evaluation and Research, Safety Testing of Drug Metabolites, Mar 2020, https://www.fda.gov/media/72279/download, Accessed 19 Feb 2022.

13.Spracklin,DouglasK.etal."Mini‐Review: Comprehensive Drug Disposition Knowledge Generated In The Modern Human Radiolabeled ADME Study". CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology, vol 9, no. 8, 2020,pp.428-434.Wiley, https://doi.org/10.1002/psp4.12540.

14. Katyayan, Kishore et al. "Excretion, Mass Balance, And Metabolism Of [14C]LY3202626 In Humans: An Interplay Of Microbial Reduction, Reabsorption, And Aldehyde Oxidase Oxidation That Leads To An Extended Excretion Profile". Drug Metabolism And Disposition, vol 48, no. 8, 2020, pp. 698-707. American Society For Pharmacology & Experimental Therapeutics (ASPET), https://doi.org/10.1124/dmd.120.000009.

15. Liao, Mingxiang et al. "Evaluation Of Absorption, Distribution, Metabolism, And Excretion Of [14C]-Rucaparib, A Poly(ADP-Ribose) Polymerase Inhibitor, In Patients With Advanced Solid Tumors". Investigational New Drugs, vol 38, no. 3, 2019, pp. 765-775. Springer Science And Business Media LLC, https://doi.org/10.1007/s10637-019-00815-2.

16. Glaenzel, Ulrike et al. "Absorption, Distribution, Metabolism, And Excretion Of Capmatinib (INC280) In Healthy Male Volunteers And In Vitro Aldehyde Oxidase Phenotyping Of The Major Metabolite". Drug Metabolism And Disposition, vol 48, no. 10, 2020, pp. 873-885. American Society For Pharmacology & Experimental Therapeutics(ASPET), https://doi.org/10.1124/dmd.119.090324.